PAED7902 Workshop · 转录组数据分析工作坊

工作坊预习笔记：转录组学原理与 microarray/RNA-seq 技术对比；GSE138458 SLE 数据六步分析——PCA、差异表达与 log2FC/FDR、ORA/GSEA 富集、GSVA 通路活性、WGCNA 共表达、细胞解卷积；R 复现指南与杨教授三点提醒，含自测题。

一、本讲信息

  • 课程：PAED7902 Introduction to Genomic Medicine and Precision Health（基因组医学与精准健康导论）
  • ** 日期**：2026-10-31
  • ** 形式**：Workshop（工作坊）。上半场讲解转录组学原理并用公共数据演示完整分析流程，下半场带领学员用 R 复现代码
  • ** 主讲**：Frank（王青云），香港大学基因组学与生物信息学方向四年级博士生，本科毕业于加州大学戴维斯分校（UC Davis）生物技术—生物信息学专业；本讲由杨教授组织并在结尾点评
  • ** 主课件**：Frank_RNAseq Tutorial-Workshop_Tutorial-Oct31st2026.pptx（68 页）

二、学习目标

  1. 理解转录组学（transcriptomics）的研究对象，以及为什么通过测量 RNA 可以推断细胞状态
  1. 区分微阵列芯片（microarray）与 RNA 测序（RNA-seq）两种技术的原理、数据性质与适用统计工具
  1. 掌握 bulk 转录组分析的六个标准步骤——主成分分析、差异表达分析、功能富集分析、通路活性打分、共表达分析、细胞解卷积——每一步的输入、方法与输出
  1. 能正确解读 log2 fold change、p 值、错误发现率（FDR）等关键统计量
  1. 课后能用 R 按课件代码复现 SLE 数据集 GSE138458 的全部结果

三、核心内容

3.1 转录组学测什么：从中心法则说起

组学（Omics）是对生物体或系统中某一整类生物分子进行集体刻画与定量的研究领域；转录组学（transcriptomics）研究的是基因组在特定时间点产生的全部 RNA 转录本（RNA transcripts）。
课件用中心法则（Central Dogma）回顾三层次分子的分工：DNA 是长期保存的完整指令库，约含 3 万个基因，留在细胞核内不直接执行功能；RNA 是临时 copied 出来的「工作指令」，细胞需要哪种功能就复制哪些基因，数量可调；蛋白质才是执行功能的分子，包括酶、受体、细胞因子、转录因子和结构成分。
为什么测 RNA 而不是直接测蛋白质？课件给出的理由是：RNA 是「容易读取的中间层」。某个基因的 RNA 量高，通常说明细胞正在使用该基因；疾病样本的 RNA 谱发生改变，说明细胞的活跃指令集变了，并可据此推断下游受影响的蛋白质与通路。课件同时强调：RNA 不是功能本身，它只是判断细胞正在发出哪些指令的最佳可行读出（best practical readout）。课堂录音补充了技术层面的原因：RNA 是线性核酸分子，现有技术容易测量；蛋白质因氨基酸组成与空间结构复杂，直接定量困难得多。

3.2 两种高通量转录组检测技术

** 微阵列芯片（Microarray）**流程五步（课件 slides 7–9）：① 载玻片上制备数千个微点位，每个点位固定数百万条针对某一基因的单链 DNA 探针（25–60 nt，序列与目标基因转录本互补）；② 提取样本总 mRNA；③ 逆转录（reverse transcription）为 cDNA 并掺入荧光标记，与芯片杂交，互补序列在高严谨条件下结合；④ 洗去未结合或结合不牢的分子以降低背景；⑤ 激光扫描激发荧光并测量各点强度——荧光量与样本中互补 mRNA 的量成正比。
RNA 测序（RNA-seq） 流程四步（slides 12–14）：① 提取总 RNA，按实验设计选取 mRNA（poly(A) 捕获）或去核糖体 RNA 的总 RNA，片段化后逆转录构建 cDNA 文库并在两端连接接头（adapters）；② 用高通量测序平台（如 Illumina）测得数百万条约 150 bp 的短读段（reads）；③ 用 HISAT2、STAR 等工具将读段比对（alignment/mapping）回参考基因组；④ 定量：比对到某基因的读段数即其表达量，读段越多转录活性越高。
两种技术产出同一类数据结构——样本 × 基因表达矩阵，但数值性质不同，必须采用不同的统计模型：
特征
Microarray
RNA-seq
数值性质
连续荧光强度
离散读段计数（非负整数）
常用尺度
log₂ 转换后
原始计数
分布
log₂ 与标准化后近似正态
过度分散（over-dispersed），常用负二项分布（negative binomial）建模
定量性质
相对定量（受限于探针集合）
更接近绝对定量
常用软件
limma（标准选择）
DESeq2、edgeR、limma-voom
课件特别提醒（slide 33）：** 不同技术 → 不同统计模型 → 不同软件包**，不可混用。

3.3 演示数据集：GSE138458（系统性红斑狼疮）

数据来自 GEO（Gene Expression Omnibus）公共数据库的 GSE138458，共 330 个样本：307 例系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）患者与 23 例健康对照，来源于 Guthridge 等 2020 年发表于 EClinicalMedicine 的横断面研究。
SLE 是一种自身免疫病：免疫系统错误攻击全身多处健康组织，常见症状包括关节肿痛、发热、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、乏力和面部红斑；病程呈发作期（flares）与缓解期交替，目前无法治愈。本讲的分析问题即：SLE 中哪些基因和通路受累？

3.4 bulk 转录组分析六步流程

** 第一步：主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）——先看数据全貌。** PCA 是线性降维方法：通过计算协方差矩阵、求特征值与特征向量，把约 2 万个基因压缩为 2–50 个主成分（principal components, PCs），从而在二维图上展示样本间整体相似性。每个主成分是全部原始基因的加权线性组合，代表样本间变异最大的方向，压缩造成的信息损失最小。本次结果（slide 25）：健康对照的点聚得更紧，患者点更分散——健康人转录组彼此更相似，患者则因疾病状态各异差异更大。PCA 也用于质控（quality control）：明显远离群体的离群点可能提示建库或 RNA 提取问题、RNA 质量低，可考虑剔除；本次数据无明显离群，未做剔除。
** 第二步：差异表达分析（Differential Expression Analysis, DEA）——找出两组间不同的基因。** 对每个基因逐一检验其在预设分组（患者 vs 对照）间的表达分布是否不同。课件给出三类核心输出：
  • ** 平均表达量**（baseMean / AveExpr / log-CPM）：用于过滤几乎不表达的弱表达基因；
  • log₂ 倍数变化（log₂ fold change, log2FC）：标准化后两组表达量之比取 log₂。例如处理组均值 6、对照组 3，比值 2，log2FC = 1，即表达翻倍。取 log₂ 的作用是让上调（正值）与下调（负值）在同一尺度上对称，便于设定阈值：log2FC = 0.5 约对应 1.4 倍变化，= 1 对应 2 倍变化；
  • p 值与多重检验校正：检验「两组该基因表达无差异」的原假设，方法视工具可为 Wald 检验、似然比检验、moderated t 检验或 quasi-likelihood F 检验。由于同时检验约 2 万个基因，即使全无真实差异也会因随机产生数百个 p < 0.05 的假阳性，因此需用 Benjamini–Hochberg 法控制错误发现率（False Discovery Rate, FDR），得到校正 p 值（padj / q 值），其含义是判定为显著的基因中预期假阳性的比例。
常用报告规则（slide 28）：padj < 0.05 且 |log2FC| > 生物学阈值（如 0.5 或 1）。本次 SLE vs 健康对照的结果（slide 30）：上调最显著的前六个基因为 FCGR1B（IgG Fc 受体，参与体液免疫与巨噬细胞吞噬）、IFI27、EPSTI1、PARP9、IFI44（均与干扰素应答/抗病毒防御相关）和 FBXO6（E3 泛素连接酶组分，参与蛋白质量调控）——提示 SLE 患者免疫处于激活状态。结果常以火山图（volcano plot）展示：横轴 log2FC，纵轴 −log₁₀ p 值（取负对数使更显著者数值更大），两条阈值线之外的点即显著差异基因。
** 第三步：功能富集分析（Functional Enrichment Analysis）——差异基因集中在哪些通路。** 差异分析产出长基因列表，逐条查阅不现实；富集分析改问：这些基因是否在已定义的生物学主题中异常集中？三大常用数据库：基因本体（Gene Ontology, GO，分生物学过程、分子功能、细胞组分三方面）、KEGG 通路（专家绘制的代谢、信号与疾病通路图）和 Reactome（反应层级的通路知识库，颗粒度比 KEGG 更细）。
  • ** 过表征分析（Over-Representation Analysis, ORA）**：课件数值例子（slide 38）——背景全集 N = 10 000 个基因，某通路含 M = 200 个（占 2%）；差异基因前景列表 n = 300，若随机则预期约 6 个落入该通路，实际观察到 k = 15 个，明显超出预期；正式结论需用 Fisher 精确检验计算 p 值。本次 136 个上调差异基因的 ORA 结果：富集最显著的是病毒防御应答相关条目，并出现干扰素相关条目。多数 SLE 患者并无病毒感染，课件解释（slide 41）：患者免疫系统把死亡细胞留下的自身细胞碎片误认为病毒样物质，导致Ⅰ型干扰素（type I interferon）通路被错误地持续激活。
  • ** 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）**：不再对基因设硬阈值，而是把全部基因按差异分析的排序统计量（Wald 统计量、带符号 log2FC 等）排序，沿列表从前往后计算运行富集分数（enrichment score, ES）——遇到通路内基因加分、不在则减分。通路基因集中在列表顶端则 ES 一路上升（通路上调），集中在底端则相反，因此上调与下调通路均可检出。本次「对病毒的防御应答」在排序列表顶部明显富集。
** 第四步：基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）——每个样本中通路有多活跃。** GSVA 把「基因 × 样本」矩阵转换为「通路 × 样本」的活性分数矩阵：先将每个基因的表达值跨样本标准化到 0–1 统一尺度，再在每个样本内对基因排序，用类似 GSEA 的随机游走为每条通路打分。之后可将通路活性与临床变量做关联。本次结果：在 200 条免疫相关通路中，NF-κB 复合物活性与 SLEDAI 评分（衡量 SLE 病情活动度）呈显著正相关（Pearson 相关系数约 0.2）。NF-κB 是 SLE 中已知病理性过度激活的转录因子，经经典与非经典信号级联促进自身反应性 B 细胞存活并驱动致病性自身抗体产生，因此该关联在生物学上可解释；但相关系数数值不大，只说明群体层面存在趋势。
** 第五步：共表达分析（Co-expression Analysis）——无先验知识地发现基因模块。** 参与同一通路、蛋白复合物或细胞状态的基因往往在各样本间同升同降，这种协同模式即共表达（coexpression）。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）不依赖已知通路注释：先计算基因两两的 Pearson 相关构成邻接矩阵，再用层次聚类（hierarchical clustering）把表达模式相近的基因归为模块（课件称「基因社区」），最后把模块与临床变量关联。本次与 SLEDAI 强正相关的模块，其基因做 GO 富集后集中在细胞周期相关条目（染色体分离、核分裂），提示患者体内细胞增殖更活跃。课件指出这与临床治疗逻辑一致（slide 58）：环磷酰胺（cyclophosphamide，化疗药，用于重症患者）通过阻断 DNA 复制中止细胞周期；吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil）抑制 IMP 脱氢酶、阻断 DNA 核苷酸合成，使增殖中的 B、T 淋巴细胞无法继续分裂——两者均属免疫抑制剂。
** 第六步：细胞解卷积（Cell Deconvolution）——估计每个 bulk 样本中各细胞类型的比例。** bulk 转录组把样本中所有细胞的 RNA 混在一起测量，只知总量、不知各细胞类型占比；解卷积以单细胞 RNA-seq 数据为参考（已知各细胞类型的特征表达谱），训练机器学习模型反推比例，方法包括线性/非负最小二乘、支持向量回归（CIBERSORT / CIBERSORTx）及单细胞信息模型（MuSiC、BayesPrism 等）。本次结果：SLE 患者的浆母细胞（plasmablasts，分泌抗体的 B 细胞）比例显著高于健康对照。这类细胞大量产生致病性自身抗体（如抗 dsDNA 抗体），沉积于组织并引发炎症；现有药物贝利木单抗（Belimumab）通过结合并阻断 B 细胞刺激因子 BLyS/BAFF、减少 B 细胞存活来缓解症状。

3.5 R 代码实操与资源

  • 代码环境：posit.cloud（浏览器端 RStudio），或本地 RStudio；
  • 讲课内容与代码全部在邮件提供的 Notion 页面，末尾附 6 个代码文件分步引导完成整套分析：第一步数据下载与处理使用 GEOquery 包，差异分析使用 limma 包（因 GSE138458 为芯片数据）；
  • 运行方式：把代码复制进 R 脚本全选运行，程序自动建立 data/raw（原始数据、探针注释为基因 symbol、质控）与 data/process（下游分析用表）目录；
  • 最终产出：行是基因 symbol、列是以 GSM 开头样本名的表达矩阵（芯片数据为连续荧光强度值），以及样本元数据（全血来源、Homo sapiens、healthy/SLE 标签，albumin、B 细胞、CD4 T 细胞等临床变量与 SLEDAI 评分）；
  • 按代码依次运行可复现课件全部结果：PCA 图（对照聚拢、患者分散）、差异分析结果表（可按 padj 或 log2FC 排序）、火山图；
  • 课件建议：遇到看不懂的代码行可直接向 AI 提问，讲解往往比讲课更细；课后完整跑一遍才能复现全部结果；
  • Capstone 机会（slide 68）：MMedSc 学生可选杨教授为导师；潜在方向包括利用转录组分析综述疾病致病特征、共病比较与药物重定位、疾病内分子内型（endotypes）识别、单细胞转录图谱构建等，可通过邮件或微信联系 Frank。

四、关键图解

【图待补】slide13-rnaseq-workflow.png — RNA-seq 文库构建与测序流程 课件 slide 13：RNA-seq 文库构建与高通量测序流程——RNA 提取、片段化、逆转录为 cDNA、加接头后上机测序得到约 150 bp 短读段。
【图待补】slide16-expression-matrix.png — 表达矩阵示意 课件 slide 16：两种技术的共同产物——样本 × 基因表达矩阵，矩阵中的值即 RNA 量，是后续所有分析的起点。
【图待补】slide25-pca.png — PCA 结果 课件 slide 25：GSE138458 数据的 PCA 结果。健康对照（聚拢的一组）转录组彼此更相似，SLE 患者（分散的一组）异质性更大；该图同时用于离群点质控。
【图待补】slide31-volcano.png — 火山图 课件 slide 31：SLE vs 健康对照的差异表达火山图。横轴为 log2FC、纵轴为 −log₁₀ p 值，两条阈值线之外的点为显著差异基因。
【图待补】slide37-ora-results.png — ORA 结果 课件 slide 37：ORA 过表征分析结果——SLE 上调差异基因最显著富集于病毒防御应答与Ⅰ型干扰素相关条目。
【图待补】slide44-gsea.png — GSEA 原理 课件 slide 44：GSEA 富集分析示意——按排序统计量遍历全部基因，通路内基因加分、非通路基因减分，得到运行富集分数 ES；「对病毒的防御应答」通路基因集中在排序列表顶部。
【图待补】slide57-module-trait.png — 模块—性状相关 课件 slide 57：共表达模块与临床性状（含 SLEDAI 疾病活动度）的相关性结果；与 SLEDAI 最正相关的模块富集于细胞周期相关条目。
【图待补】slide63-deconvolution.png — 细胞解卷积结果 课件 slide 63：细胞解卷积结果——SLE 患者浆母细胞（plasmablasts）比例显著高于健康对照，与致病性自身抗体的产生相关。

五、课前思考 / 自测

以下问题提炼自课前读物 Primer 文末的自查清单，建议上课前逐条自问：
  1. RNA-seq 测量的是什么？基因表达矩阵的行、列和数值分别代表什么？
  1. 两个样本测序深度不同（如 2000 万 vs 4000 万读段）时，为什么不能直接比较原始计数？标准化（normalization）解决的是什么问题？
  1. log2FC = +1 与 −1 分别代表什么变化？为什么要用 FDR（padj）而不是原始 p 值报告结果？
  1. PCA 图上每个点代表什么？如果某样本远离所有群体，可能有哪些原因？
  1. 差异表达之后为什么还要做通路富集？ORA（设阈值取基因列表）与 GSEA（全基因排序）的核心区别是什么？
Primer 还列出三个常见错误可作自检：孤立解读单个基因（应看模式而非单基因）、忽视样本间变异（重复样本的重要性）、把相关当因果（RNA-seq 识别的是关联，不必然是机制）。

六、参考材料

  • 主课件：Materials/Frank_RNAseq Tutorial-Workshop_Tutorial-Oct31st2026.pptx（68 页，本笔记主干依据）
  • ** 课前读物**：Materials/Primer for Transcriptome Data Analysis .docx（bulk RNA-seq 概念入门，含自查清单、三个常见错误与 StatQuest、DESeq2、Conesa 2016 综述等学习资源）
  • ** 代码教程**：Materials/1.download_GEO.html（Tutorial 1: Download and process GEO data，即 6 个代码文件的第一步）
  • ** 课后反思**：Materials/Frank_Workshop_Reflection.docx（围绕数据异质性与方法原理的反思材料）
  • ** 数据来源文献**：Guthridge JM 等，EClinicalMedicine 2020;20:100291（GSE138458，PMID: 32154507）

七、课堂要点补充（来源：课堂录音）

杨教授在 Frank 讲完后提出三点提醒，是本讲结论部分的重点：
  1. ** 先体会数据的复杂性。** PCA 图并不是干净的两簇：对照组比患者组聚拢，但彼此仍有差异，来源是测量误差（方法学并非百分之百准确）加个体差异（健康人之间也不同）；患者组还多一层疾病异质性——同患狼疮，不同人的病情可以差别很大。杨教授引用《安娜·卡列尼娜》的开头说明这一现象，并指出这正是研究需要大样本的原因：需要足够数据来克服个体差异。对照样本的差异来源是测量变异与个体差异两个因素，患者则还需加上疾病异质性这第三个因素。
  1. ** 追问每个统计步骤为什么存在。** 标准化、差异分析、多重检验校正、共表达、通路与基因集富集——每一步各自要克服什么困难、强项与局限是什么、对应哪个生物学问题，比跑通代码更重要。
  1. ** 统计显著不等于个体层面成立。** 以 NF-κB 通路活性与 SLEDAI 评分的相关为例：p = 0.012 在统计上显著，但相关系数约 0.2，属于弱相关，只在群体层面成立；个体层面情况要复杂得多。真实数据杂乱、疾病异质、数据质量与样本量有限，仍要回答问题，关键是清楚工具箱中每种工具的优劣并组合使用。
杨教授将学习分为两个层次：第一层是学会并亲手运行这些工具；第二层是理解每一个处理步骤在克服什么难以克服的困难。
Frank 的实操补充：课后按 Notion 链接末尾的 6 个代码文件在自己电脑上用 R 完整复现分析流程；看不懂的代码行可直接问 AI；杨教授课题组有 SLE 的 RNA-seq 数据可用，网上亦有大量单细胞数据；对转录组分析或 Capstone 项目感兴趣的同学可通过邮件或微信联系 Frank，并与杨教授沟通导师事宜。
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