MSBS7102 Lecture 8 · DNA 测序技术导论

1. 本讲信息

课程：MSBS7102 Foundations in Biomedical Data Science（生物医学数据科学基础）

日期：2026-10-30，地点 LT3 & LT4

讲者：Dr. Yan Li（BGI 深圳，高级研究员，liyan@genomics.cn）

主题：Introduction to DNA Sequencing Technologies——DNA测序技术从第一代到第三代的发展、原理、准确度、读长与适用场景，及其支撑的人类基因组大科学项目

说明：本讲为 BGI 团队连续四周授课模块的第一讲；随堂发放的 Nature《Milestones in Genomic Sequencing》增刊（2021）作为配套阅读材料

2. 学习目标

区分DNA测序（DNA sequencing） 与PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction） ：前者测定未知序列的碱基组成与排列，后者在已知目标序列前提下对特定片段做指数扩增。

掌握三代测序技术的核心原理：Sanger 链终止法、大规模平行测序（以 Illumina、MGI 为代表）、单分子长读长测序（PacBio、Oxford Nanopore）。

理解读长（read length） 、准确度 、覆盖度（coverage） 等技术指标的含义，并能根据研究目标选择测序策略。

了解人类基因组计划（HGP）、HapMap、1000 基因组、T2T 与泛基因组等国际项目的技术路线与相互关系。

3. 核心内容

3.1 测序与 PCR 的区别

课件给出两个定义（Lecture 8 主课件 p3）：

DNA测序 ：以单碱基分辨率确定一条 DNA 分子的线性核苷酸排列顺序，且每个位置都带有可量化的错误概率。

PCR ：对目标 DNA 片段的体外酶促扩增，依赖引物（primer）的特异性，对已定义的模板序列实现指数级富集。

课堂录音用核酸检测举例：新冠核酸检测只回答"样本中是否存在这段已知序列"（PCR 即可）；而测序回答"这段序列究竟是什么、按什么顺序排列"，不要求预先知道序列内容。二者是"检测已知"与"读取未知"的关系。

3.2 技术发展总览：三代技术并行不悖

课件用时间线（p4）梳理五个节点：1970 年吴瑞（Ray Wu）建立引物延伸（primer extension） 方法 → 1977 年 Sanger 测序 → 2005 年大规模平行测序 → 2009 年长读长技术兴起 → 2017 年至今短读长与长读长并用。所有后续技术都建立在引物延伸、"边合成边测序（sequencing by synthesis）"这一共同原理之上（课堂录音强调）。

需要特别注意（课堂录音）：三代技术并非新旧淘汰关系 ，目前三代都在实际使用中，应按研究目的选择——Sanger 用于验证，短读长用于大规模高精度变异检测，长读长用于重复区域与结构变异。

3.3 第一代：Sanger 链终止法

原理（又称链终止法，chain termination method，1977 年由 Frederick Sanger 及同事建立；1980 年 Sanger 与 Walter Gilbert 因核酸序列测定贡献获诺贝尔化学奖）：

在 DNA 合成反应体系中混入少量双脱氧核苷酸（ddNTP） 。ddNTP 与普通脱氧核苷酸（dNTP） 的差别在于：ddNTP 缺少 3′ 羟基（3′-OH），一旦被聚合酶掺入新链，下一个核苷酸无法与之连接，链延伸就此终止（课件 p7 的 dNTP/ddNTP 对比图）。

ddNTP 与 dNTP 混合后，每个位置随机发生终止，产生一系列长度相差一个碱基的片段；片段带荧光标记。

通过毛细管电泳（capillary electrophoresis） 按长度分离片段，激光激发荧光检测器逐个读取，从短到长重建序列，输出彩色峰形的色谱图（chromatogram） （课件 p8）。

指标与地位 ：读长 500–1,000 bp；单碱基准确度约 99.999%（质量值 Q50，即错误概率 10⁻⁵），至今仍是准确度标杆。人类基因组计划（1990–2003）完全依赖 Sanger 测序，耗时约 13 年、花费约 30 亿美元。

为何仍是"金标准（ground truth）" （课件 p10）：准确度无出其右；单分子读长中等、无需组装；流程简单，一个扩增子当天出结果；小规模（1–20 个靶点）时成本效益高。典型用途包括：NGS 检出变异的 orthogonal 验证（临床与罕见病报告前必须 Sanger 复核，课堂录音强调）、克隆/质粒/CRISPR 编辑确认、单基因与家系靶向检测、微生物 16S/ITS 鉴定与分型、STR/MSI 等片段分析。

局限：通量低（一次反应只读一条序列）、速度慢；对长串联重复区域表现不佳——聚合酶滑动导致信号压缩与"stutter"峰，难以判断重复长度（此时需长读长技术）。课堂录音补充：Applied Biosystems 公司为 Sanger 法开发了自动化测序仪，使其走出实验室成为第一代测序的代名词。

3.4 第二代：大规模平行测序（NGS）

核心突破 （课件 p11）：借助纳米技术把数百万个测序反应缩小到一块芯片上同时进行，把"串行化学"变成"并行数据产生"——从 Sanger 的"1 根毛细管、一次 1 条读段"跃升到一次运行数十亿条读段。课堂录音解释：芯片上每个点是一个纳米级反应容器，所有点位的测序反应同时发生。

读长与准确度 ：读长通常 100–300 bp，整体错误率约 1%（低于 Sanger），适合大规模重测序与变异检测。

四条技术路线 （课件 p12–15，图示均改编自 Goodwin et al., Nat Rev Genet 2016）：

平台	扩增方式	信号检测	特点与现状
Illumina （CRT，可逆终止子边合成边测序）	固相桥式 PCR（bridge PCR）在流通池表面生成 1–2 亿个克隆簇	每轮掺入一种带荧光的 3′ 封闭 dNTP，TIRF 成像后切除荧光基团再进入下一轮	读长 2×150–2×300 bp，错误率 <0.1%；市场份额最大（MiniSeq 到 NovaSeq）；局限：短读长、参考偏差、无长距离定相（phasing）
Roche 454 （焦磷酸测序，pyrosequencing）	乳化 PCR（emulsion PCR），磁珠置于皮升级微孔	每轮流入一种 dNTP；掺入释放焦磷酸（PPi），经 ATP 硫酸化酶—荧光素酶级联发光，光强与同聚物长度成正比	2005 年首个高通量 NGS 平台，早期读长最长（约 700 bp）；同聚物区易发生 indel 错误；2016 年停产
Ion Torrent （半导体测序）	乳化 PCR 磁珠	每次掺入释放 H⁺，pH 变化约 0.02 单位，由 CMOS-ISFET 传感器直接记录电压——无需标记、无需相机	首个非光学平台，运行最快（2–7 小时），读长约 400 bp，低价台式机；同聚物 >6–8 bp 时 indel 错误明显
MGI / Complete Genomics （DNA 纳米球，DNB）	滚环扩增（rolling-circle amplification, RCA）在溶液中进行：片段经四轮接头连接与环化形成环状模板，RCA 生成串球状 DNB，逐一沉积到规则阵列芯片	组合探针-锚定连接（cPAL）或边合成边测序（cPAS）	无需磁珠与表面 PCR，始终以原始分子为模板、避免扩增误差累积（课堂录音：理论准确度略高）；单张芯片可达 200 亿个 DNB，通量高、成本低；DNBSEQ-T7/G 系列支撑高通量 WGS

市场现状 （课堂录音）：目前主流仅剩 Illumina 与 MGI 两条路线。454 与 Ion Torrent 退出的原因在于其信号依赖较复杂的化学反应（酶级联发光或 pH 检测），受反应条件影响大、稳定性差；Illumina 与 MGI 采用荧光标记，信号稳定、易识别。

短读长的实际表现 （课件 p16，IGV 比对示例）：约 150 bp 的读段堆叠在参考基因组上，外显子区覆盖均匀，但在重复/旁系同源区域（如 STRC 基因座）覆盖度骤降、变异检测不可靠；单核苷酸变异（SNV）表现为有色的错配碱基，而大的结构事件只能靠插入片段长度偏差间接推断，读段本身无法跨越。

3.5 第三代：单分子长读长测序（TGS）

与 NGS 的本质区别（课件 p17）：无克隆扩增、直接观测单个分子 ，读长提高约 100 倍——从 100–300 bp 跃升至 10 kb 至 Mb 级，使组装（assembly）、定相与结构变异（structural variation, SV）检测可以直接进行。

PacBio SMRT（单分子实时测序，single-molecule real-time） （课件 p18）：

原理：单个 DNA 聚合酶固定在零模波导（zero-mode waveguide, ZMW） 纳米孔底部；环状 SMRTbell 模板被聚合酶反复读取多轮，荧光标记 dNTP 的实时光脉冲被记录；多轮读取生成环形一致性序列（circular consensus sequence, CCS） ，多轮互相纠错将准确度提升到 HiFi（>Q20）。

特点：读长 10–50 kb 以上；单分子、无克隆扩增偏差；适合从头组装、结构变异、全长转录本（isoform）测序。局限是历史成本较高、通量较低（Sequel II / Revio 在改进）。课堂录音补充：环化使同一片段被反复读取，一轮出错可被其他轮纠正，因此读长长且准确度较高，且不再需要终止与扩增。

Oxford Nanopore（纳米孔测序） （课件 p19）：

原理：解旋酶"马达"牵引单链 DNA 穿过嵌在膜上的生物孔蛋白（早期 α-hemolysin，后采用工程化 CsgG 等）；碱基通过时引起特征性离子电流变化（"squiggle"电流信号），实时解码为 k-mer 序列。无需标记核苷酸、无需光学系统、不依赖 DNA 合成。

特点：读长可达 Mb 级，是目前读长最长的技术；可直接测天然 DNA/RNA，无扩增偏差；设备便携（MinION / Flongle）、数据实时输出，支持自适应采样；能从电流信号直接检测 DNA 甲基化等表观遗传修饰，无需亚硫酸氢盐处理。局限：原始单读错误率较高（约 5–15%），靠共识与 duplex 读数改进。

适用场景（课堂录音）：判断串联重复长度、检测大片段缺失/插入等结构变异、基因组组装；与二代互补——二代短读长做高精度大规模变异检测，三代长读长解决二代跨不过去的区域。

3.6 测序覆盖度与实验设计

覆盖度（coverage / depth） ：平均每个碱基被读段覆盖的次数。核心公式（课件 p21）：

Coverage (x) = (读段数 Number of reads × 读长 Read length) / 基因组大小 Genome size
所需读段数 Reads needed = (目标覆盖度 C × 基因组大小 G) / 读长 L

各变量含义：G 为基因组大小（人类约 3.1×10⁹ bp）；L 为读长（如每条 150 bp）；paired-end 双端测序时每个片段贡献 2×150=300 bp。

算例（30× 人类全基因组测序，2×150 bp） ：总碱基数 = 30 × 3.1×10⁹ = 9.3×10¹⁰ bp；每对读段 300 bp；所需读段对 = 9.3×10¹⁰ / 300 ≈ 3.1×10⁸，即约 3.1 亿对读段。

典型覆盖度目标 （课件 p21）：人类 WGS 30–40×；外显子组 50–100×；RNA-seq 视问题而定；长读长 WGS（HiFi）15–30×；临床靶向 panel 500–1000×。课堂录音强调：覆盖度直接决定变异检出能力——检测癌症相关突变需要高覆盖度；检测结构变异则需要长读长；实验设计应根据目标选择读长与覆盖度的组合。

3.7 人类基因组大科学项目

人类基因组计划（HGP, 1990–2003） （课件 p23–26）：美、英、法、德、日、中六国合作，产出约 32 亿碱基对、约 2 万个蛋白编码基因，任意两人序列一致性 99.9%；2001 年 Nature 发表首张草图，2003 年完成参考序列；约 8% 的缺口（主要是重复序列）未被解决，且样本以欧洲裔为主、不代表全球人群（课堂录音：当时每个碱基成本约 1 美元，总成本约 30 亿美元）。

技术路线为分级鸟枪法（hierarchical shotgun） ：先把约 150 kb 的人类 DNA 插入细菌人工染色体（BAC） 载体、转入大肠杆菌扩增（Step 1–2）；逐个 BAC 克隆先锚定到染色体物理图上，再做鸟枪法 Sanger 测序，最后借助重叠 k-mer 路径组装（Step 3–4）。"先作图、后测序"是该路线区别于 Celera 全基因组鸟枪法的关键。配套阅读（Nature Milestones 增刊）补充：HGP 于 1998 年实施"百慕大原则"（大于 1 kb 的组装序列 24 小时内自动公开），2004 年《劳德堡协议》进一步确立数据共享规范，被视为生物医学开放获取的先声。

SNP 与 HapMap（2002–2007） （课件 p29–32）：

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） ：人群中可变的单碱基位点，人类约有 3×10⁷ 个，每个 SNP 以"rs"编号标识（如 rs1006737）。课件对比了 mutation（突变）与 polymorphism（多态性）两个概念。

连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD） ：减数分裂重组并非均匀发生，存在重组热点 ，把基因组切分为若干单倍型块（haplotype block） ；块内位点倾向于一起遗传，块间组合更多样。人类基因组约由 2,500 个单倍型块组成。

HapMap 项目 ：不测全基因组，而是用 DNA 基因分型芯片（Affymetrix / Illumina）只对每个块的代表性标签 SNP（tag SNP） 做分型（最多约 100 万个 SNP），即可捕获整段单倍型，大幅节省成本。取样了约鲁巴（非洲）、西欧裔、日本与汉人三组人群。课堂录音补充：非洲人群的单倍型块比欧洲、东亚人群更短，说明其经历的重组与世代更多，支持"近期非洲起源（Recent African Origin）"学说；仅采样三组人群也存在采样偏差。

1000 基因组计划（1000 Genomes, 2008–2015） （课件 p33–35）：对全球 2,504 人、26 个人群做全基因组+外显子测序，鉴定低至 1% 频率的变异（含常见与罕见变异、插入缺失和结构变异）；WGS 深度从第一阶段约 4–6× 提高到第三阶段约 30×（课堂录音：后者即目前临床 WGS 常用深度）；数据开放下载，是最大的开放获取人类 WGS 资源。等位基因频率可从 dbSNP 查询——课件示例：HERC2 基因 rs12913832 的衍生 G 等位基因是蓝眼的主要相关变异，在欧洲人群频率约 60%（课堂录音），在东亚人群中很低。

T2T 完整基因组（Telomere-to-Telomere, 2019–2022） （课件 p38）：T2T 联盟结合 PacBio HiFi（50–70×）与 Oxford Nanopore 超长读段（30–100×）及抛光，补上了 HGP 遗留的约 8% 重复序列缺口，发布首个无缺口人类基因组（T2T-CHM13），解决了着丝粒与重复区域。课堂录音指出其局限：T2T 只代表一个个体（CHM13 细胞系），下一步是为全球不同个体测序。

泛基因组（Human Pangenome, 2019 至今） （课件 p36）：现有线性参考基因组仍有错误、缺口且不含全球遗传多样性；人类泛基因组参考联盟（HPRC）采用长读长优先策略（每基因组约 30–60× 长读段），已产出 94+ 个来自不同人群的二倍体组装，把不同个体携带的变异作为分支纳入图基因组（graph genome） 结构。课堂录音补充：中国泛基因组联盟覆盖 56 个民族的不同地区样本，新疆人群在聚类上偏向东亚与西欧亚的混合。

各项目技术路线对照 （课件 p39）：

项目	年份	测序技术	深度	交付成果
HGP	1990–2003	Sanger；BAC 逐克隆分级鸟枪法	约 6–10×	首个人类参考基因组；约 99% 常染色质区、99.99% 准确度
HapMap	2002–2007	SNP 基因分型芯片	约 100 万 SNP	单倍型图与 LD 块；GWAS 的基础
1000 Genomes	2008–2015	Illumina 短读长 WGS+外显子	WGS 4–6×（Phase III 30×）；外显子 20–60×	低至 1% 频率的变异目录；2,504 人、26 个人群
T2T-CHM13	2019–2022	PacBio HiFi + ONT 超长 + 抛光	HiFi 50–70×；ONT 30–100×	首个无缺口人类基因组；解决着丝粒与重复区
Human Pangenome	2019 至今	PacBio HiFi + ONT 超长（长读长优先）	每基因组约 30–60× 长读段	94+ 个多样化二倍体组装；捕获结构变异

3.8 配套阅读：Nature Milestones in Genomic Sequencing

随堂发放的 Nature 增刊（2021 年 2 月）以 17 个里程碑回顾测序技术二十年：HGP（2001）、宏基因组学（2004）、下一代测序（2005）、ChIP-seq（2007）、个人基因组与癌症基因组（2008）、RNA-seq（2008）、长读长技术（2009）、全外显子组测序（2009）、Hi-C（2009）、单细胞测序（2009）、古 DNA 测序（2010）、大群体变异目录与 ENCODE（2012）、泛基因组（2014）、"白金级"基因组（2017）、T2T 无缺口染色体（2020）。该时间线与本讲主线一致：技术进步（NGS → 长读长）持续推动项目上限（参考基因组 → 群体变异 → 完整基因组 → 泛基因组）。

4. 关键图解

课件 p4：测序技术与策略发展时间线——1970 吴瑞引物延伸 → 1977 Sanger（一个下午读数百碱基）→ 2005 大规模平行测序 → 2009/2017 长读长（1 小时数十亿碱基）。

课件 p7：dNTP 与 ddNTP 的结构对比。dNTP 的 3′-OH 允许链继续延伸；ddNTP 以氢原子取代 3′-OH，掺入后链终止（"Chain stops"）。

课件 p12：Illumina CRT 原理——左为"加碱基→成像→切荧光"的循环；右为固相桥式 PCR 生成 1–2 亿个克隆簇。

课件 p15：MGI/Complete Genomics DNB 技术流程——四接头环状模板经滚环扩增生成 DNA 纳米球，逐一沉积到规则阵列芯片再行 cPAL/cPAS 测序。

课件 p19：马达蛋白牵引单链 DNA 穿过孔蛋白，离子电流的"squiggle"信号被实时解码为 k-mer 序列，无需荧光标记与光学系统。

课件 p21：覆盖度公式 Coverage = (读段数 × 读长) / 基因组大小，及 30× 人类 WGS（2×150 bp）约需 3.1 亿对读段的算例与各类应用的典型深度。

课件 p31：基因组组织为单倍型块，每块只需检测约 1 个标签 SNP（红色）即可识别整段单倍型，无需测定全部 SNP。

课件 p38：T2T 联盟补齐 HGP 遗留的 8% 缺口；图中各染色体新完成区域以红色标示（Science 2022 年 4 月刊封面）。

5. 课前思考/自测

新冠核酸检测（PCR）与全基因组测序（WGS）在"对序列的已知程度"上有何本质不同？为什么 PCR 不能告诉你序列上某个新突变的位置？

ddNTP 缺少 3′-OH 为何能终止链延伸？由此产生的"一系列长度相差一个碱基的片段"是如何被转变成可读序列的？

同为二代平台，Illumina（荧光）、Ion Torrent（pH）与 MGI（纳米珠扩增）的信号产生机制各有何代价？为什么同聚物区域是 454 与 Ion Torrent 的弱项？

拟检测一个基因的串联重复扩展突变，应选择 Sanger、短读长 NGS 还是长读长测序？理由是什么？

30× 人类 WGS 用 2×150 bp 读段约需多少对读段？若改用 20× 且读长 2×100 bp，需要多少？（用课件 p21 公式计算。）

6. 参考材料

主课件 ：Materials/SBMS7202-Lecture-8-Introduction to DNA sequencing Technologies-1029.pdf（DNA Sequencing Technologies: From Sanger to long-read, Dr. Yan Li, 39 页）

辅助材料 ：Materials/Milestones in Genomics Sequencing.pdf（Nature Milestones: Genomic Sequencing 增刊，2021 年 2 月，17 个里程碑时间线）

课堂录音 ：Recordings/MSBS7102-1030-summary.md / MSBS7102-1030-transcript.md

课件中反复引用的文献：Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet 17, 333–351 (2016)；International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409:860 (2001)

7. 课堂要点补充（来源：课堂录音）

开场：AI 虚拟细胞挑战赛 。由美国 Arc Institute 主办（课程老师共同组织），任务是预测特定基因敲低（knockdown）在不同细胞背景下的响应，今年强调多上下文泛化与零样本预测，不提供新训练数据，以未见的实验扰动数据评分；参考模型为 State model。提交截止 2026-11-05；配套黑客松于 11 月 2–3 日 9:00–18:00 举行（第一天 Mingway block 201，第二天 Mingway block 304），可扫海报二维码、加微信群或经 Moodle 报名。

课程安排 ：Dr. Yan Li 将代表 BGI 连续授课四周，本周主题为测序技术并延伸到数据分析原则；本讲中途在 Moodle 发布了一道小测验（quiz），课间休息 10 分钟。

Sanger 准确度与用途 ：老师强调 Sanger 准确度至今无二代、三代技术可及；用二代鉴定疾病致病变异后，出报告前通常需 Sanger 验证复核。

平台淘汰原因 ：454 与 Ion Torrent 的信号依赖较复杂的化学反应，受反应条件影响大、稳定性差；Illumina 与 MGI 用荧光标记，信号稳定易识别，故成为现存主流。

HGP 细节 ：覆盖度约 6–10×；当时每碱基成本约 1 美元、总成本约 30 亿美元；把人类 DNA 片段导入大肠杆菌扩增后做鸟枪法测序，再组装。

人群采样偏差 ：HGP 样本以欧洲裔为主；HapMap 仅采样三组人群；非洲人群单倍型块更短、重组与世代更多，支持近期非洲起源说；1000 基因组将采样扩展到欧洲、东亚、非洲、南亚等人群。

中国泛基因组 ：中国泛基因组联盟覆盖 56 个民族的不同地区样本；新疆人群聚类偏向东亚与西欧亚混合。全球泛基因组目前仍以欧洲样本为主，目标是覆盖全球人群。