一、本讲信息
- 课程 ：MSBS7101 Essential Skills in High-throughput Sequencing Data Analysis（高通量测序数据分析核心技能，课程码亦标注 SBMS7201）
- 讲次 ：Lecture 4（课件文件名 L4）
- 日期 ：2026-09-22
- 讲者 ：Dr. Rachel Kwan（Dr. HL Kwan），香港大学生物医学院（School of Biomedical Sciences），rkwanhl@hku.hk
- 主课件 ：
L4_Introduction to Genome Informatics_2026.pdf（30 页）
二、学习目标
依据课件第 2 页：
- 了解标志性的基因组项目（notable genomic projects）及其对基因组研究的贡献；
- 描述基因组信息学中各类测序技术（sequencing technologies）的原理与应用；
- 理解针对特定研究目的的典型数据分析方法；
- 说明基因组信息学面临的挑战以及伦理与法律层面的考量。
三、核心内容
3.1 出发点：人类基因组里有什么信息
人类基因组（human genome）约有 30 亿碱基对（~3 billion base pairs） ，DNA 缠绕组蛋白形成核小体（nucleosome）并折叠为染色质（chromatin）（课件 p3）。这些信息如何存储查看、又如何获得，引出本讲三条主线：基因组计划 → 测序技术 → 数据分析 （课件 p4–5）。此前课程在 UCSC Genome Browser 中查看的基因组注释，正是下述各大计划的产物（课堂录音）。
3.2 标志性基因组计划
课件 p6 以一条时间线串联主要项目：
- 人类基因组计划（Human Genome Project, HGP） ：测定人类参考基因组序列，2003 年完成（课堂录音）。
- 国际单倍型图谱计划（International HapMap） ：研究基因型—表型关联（genotype-phenotype correlation），把特定遗传组成对应到特定表型（课堂录音）。
- 1000/100,000 基因组计划（1,000/100,000 Genomes） ：对大量个体测序，建立常见 SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）数据库——UCSC Genome Browser 的 dbSNP track 即源于此（课堂录音）。
- DNA 元件百科全书计划（ENCODE） ：系统标注基因表达调控元件（转录起始位点、内含子/外显子边界等）；课件提到的 GENCODE 基因注释（课件标注 v48；课堂练习实际用 v50）为其延伸项目。
- 人类泛基因组计划（Human Pangenome Project） ：HGP 参考序列主要来自白人群体，该计划测定不同族群与遗传背景的基因组，构建更全面的人类进化与性状信息（课堂录音）。
香港基因组计划（Hong Kong Genome Project, HKGP） （课件 p7）：香港首个大规模基因组测序计划，2021 年启动，由位于科学园的香港基因组研究所（HKGI）支持；目标是帮助患者及家庭寻找潜在致病遗传变异，覆盖未确诊疾病（undiagnosed disorders）、遗传性癌症及其他精准健康个案。与建立参考基因组不同，HKGP 更侧重香港人群的疾病—基因型关联，需经医院或 HKGI 转介，并非公开服务（课堂录音）。
3.3 芯片技术（Array Technology / Microarray）
芯片是最早期的"测序类"技术，并不逐个读取碱基 ，而是检测样品中已知序列的有无与丰度（课件 p9–11；课堂录音）：
- 原理 ：芯片（约硬币大小，课堂录音）表面网格的每个位点固定一条已知序列的探针（probe）；样品序列（DNA 或逆转录的 cDNA）与互补探针杂交产生荧光信号，据信号位置与强度判断样品含哪些序列及其丰度。
- 典型分析流程 ：背景校正（background correction，消除成像背景噪声，课堂录音指出芯片边缘噪声更强）→ 标准化（normalization，使同一芯片内及多张芯片间信号可比）→ 质控（批次效应与离群值去除）→ 定量与统计分析（差异表达、临床关联等）。
- 信号强度 ≠ 真实丰度 的四个原因：非特异/交叉杂交（non-specific/cross-hybridization）、探针特异性效应（probe-specific effects）、信号饱和（signal saturation，达到检测上限后被截断）、技术伪影（technical artifacts）。
- 四类常见芯片 （靶标必须是已知、可转为 cDNA 的分子）：
- 表达芯片（expression array） ：探针针对外显子区域，检测基因表达比例，使用 mRNA 逆转录的 cDNA；
- 比较基因组杂交芯片（array comparative genomic hybridization, aCGH） ：探针定位到特定基因组基因座，用于疾病相关的拷贝与序列组成检测；
- SNP 芯片（SNP array） ：每个位点放两种等位基因探针，判断基因型（纯合/杂合）及拷贝数变化；
- 甲基化芯片（methylation array） ：探针针对经亚硫酸氢盐（bisulfite）转换的 DNA——未甲基化的胞嘧啶被转换为尿嘧啶，甲基化胞嘧啶受保护，据此定量 DNA 甲基化水平。
- 根本局限 ：芯片上没有的序列就无法被检测（"What the array does not have cannot be detected!"）。
- 至今仍使用的原因 ：成本效益高、有大量历史遗留数据（legacy data）可供比对、处理与分析流程非常成熟（包括临床验证用途），医院针对已知生物标志物的检测仍常用芯片（课堂录音）。
3.4 测序技术的三代演进
第一代：Sanger 测序与鸟枪法（Shotgun sequencing）
课件 p13：HGP 时期存在 NIH（政府）与 Celera（公司）的竞争：
- 分级鸟枪法（hierarchical shotgun, NIH） ：先将基因组切成大片段，克隆到细菌人工染色体（BAC）并作图谱，再对各片段分别随机打碎、Sanger 测序、按归属拼回；
- 全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun, Celera） ：不分段，直接整条基因组随机打碎、全部测序，再借助重复区域的序列重叠拼装。
- 重复区域（repetitive regions） 是拼装的主要困难。
- Sanger 测序原理 （课堂录音）：链终止法（termination）——掺入带荧光标记的修饰碱基即终止延伸，需同一片段的大量拷贝使终止发生在各可能位置；检测的是平均信号，序列越长噪声越大，故只对短片段可靠。
第二代：短读长测序（short reads，需扩增）
课件 p14：读长一般为 300 bp 以内（Illumina 约 150 bp，课堂录音）：
- 边合成边测序（sequencing by synthesis, Illumina/Solexa）——详见 3.6；
- pH 检测测序（Thermo/Ion Torrent） ：检测碱基掺入时释放的氢离子引起的 pH/电流变化（课堂录音：样品先经乳液 PCR（emulsion PCR），每个油滴内理论上只含一个 DNA 片段进行扩增，之后每孔一粒磁珠测序；同聚物重复区域同样难以准确判断碱基个数）；
- 纳米球测序（sequencing by nanoball, BGI） 。
第三代：长读长单分子测序（long reads，无需扩增）
使用更长的原始 DNA 片段（1 kb 以上，甚至 Mb 级），无需 PCR 扩增 （课件 p18）：
- 纳米孔测序（nanopore sequencing, Oxford Nanopore/ONT）——详见 3.7；
- 纳米结构边合成边测序（PacBio HiFi）——详见 3.8。
选择技术时的考量因素 （课件 p14）：准确性（accuracy）、通量（throughput）、读长（read length）、速度（speed）、成本（cost）。课堂录音补充：研究对象是全新物种、无参考基因组时宜选长读长（利于拼装）；已知目标、追求低错误率与短周期时宜选 Illumina；长读长测序耗时可达数天，短读长数小时至过夜即可。
成本曲线 （课堂录音）：HGP 完成时测一个人类基因组需数百万美元；二代、三代测序相继大幅降低成本；2024 年 Ultima Genomics 宣称其 UG 100 平台可以 100 美元测一个人类基因组（讲者尚不了解有实验室实际使用）。
3.5 NGS 的三种策略与"深度"概念
课件 p15 用表格对比三类测序策略：
ㅤ | 靶向测序（Targeted / panel） | 全外显子组测序（Whole exome, WES） | 全基因组测序（Whole genome, WGS） |
覆盖范围 | 特定基因 | 所有外显子 | 所有基因与非编码区 |
可检测变异 | 靶区内序列变异 | 编码序列变异 + 拷贝数变异（有限） | 另包括结构变异（structural variants） |
成本 | 最经济 | 较经济 | 最昂贵 |
深度（depth） | >500X | >50–100X | >30X |
- 深度（depth） （课堂录音）：同一条读段（read）被测序的平均次数，如 30X 即每条读段平均测 30 遍；深度越高结果越可靠（个别错误被多数正确信号纠正），靶区越小越易达高深度，故 panel 可超 500X 而 WGS 约 30X。
- 拷贝数变异（copy number variation, CNV） ：染色体或基因的拷贝数异常（如 3 拷贝而非 2 拷贝）；WES 只测外显子，难以区分真实拷贝升高与扩增偏差（课堂录音）。
- 与芯片相比，NGS 动态范围更大 （只受测序深度限制），但数据分析与管理难度更高（课件 p15）。
3.6 Illumina 边合成边测序（Sequencing by Synthesis）
课件 p16 + 课堂录音，流程为：
- 片段化（fragmentation） ：将 DNA 打断为短片段（约 150 bp）；
- 接头连接（adapter ligation） ：两端连接约 50 bp 接头，其作用有二——携带标签（barcode/index）供多样本混测后区分归属，并使片段锚定在测序芯片（flow cell）表面；
- 桥式扩增（bridge amplification） ：片段在 flow cell 上弯成"桥"扩增，形成由相同片段组成的簇（cluster），以放大可检测信号；
- 可逆终止子合成测序 ：每次掺入一个带荧光标记的碱基（可逆终止），拍摄信号后切除荧光基团，聚合酶继续掺入下一个碱基——与 Sanger 的永久终止不同，可对同一片段连续读取；
- 信号判读 ：每个循环取每个簇的主导信号确定碱基。
错误来源 （课堂录音）：扩增本身会引入错配；同一簇内不同链随循环推进失去同步（dephasing，同聚物/重复区域尤甚），读段 3' 端质量随之下降——这是 Illumina 只适合短读长的原因。比对后某位置若出现孤立的不同碱基（如一列 C 中的 T），需判断是测序错误还是真实变异。
3.7 纳米孔测序（Nanopore Sequencing, ONT）
课件 p18 + 课堂录音：
- flow cell 上有许多微孔，每孔嵌入一个改造的纳米孔蛋白 ；马达蛋白（motor protein） 把 DNA 链引导至孔口、解旋并控制其穿膜速度，使仪器有足够时间逐碱基检测；
- 每个碱基穿过膜时对电流产生特征性扰动（characteristic disruption in electric current），据此识别碱基；甲基化等修饰碱基扰动模式不同 ，需专门优化流程才能检测；
- 连续重复碱基区域判读错误率较高；
- 设备极为便携：测序仪约 USB 转接头大小，flow cell 约手机厚度的三分之一，接入笔记本电脑即可测序（课堂录音）。
3.8 PacBio HiFi 测序
课件 p19 + 课堂录音：
- 文库制备将基因组 DNA 连接成环状模板（circular template） ，退火引物并结合 DNA 聚合酶；
- 聚合酶锚定在纳米级零模波导孔（zero-mode waveguide, ZMW）底部，仪器只检测孔底小范围内的荧光信号，减少游离链的背景噪声；
- 掺入的碱基带荧光标记，信号被检测后荧光基团被切除，合成得以继续，对环状模板可反复读取；经片段大小选择后平均读长约 15–25 kb ；
- 课堂讲解提到：PacBio 可对双链 DNA 的两条链分别读取，两条链的测序结果可互相校验，不一致处提示可能存在测序错误。
3.9 其他测序类型（按研究目的选择）
课件 p20（多属短读长策略，课堂录音）：
- 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq） ：先交联（crosslink）蛋白与 DNA，用抗体（如针对特定聚合酶或组蛋白修饰的抗体）富集被该蛋白结合的 DNA 片段，解交联后测序，得到蛋白结合图谱（binding motifs）、基因本体、差异表达与染色质修饰信息；
- 转座酶可及染色质测序（ATAC-seq） ：利用转座酶（transposase）同时完成片段化与加标签（fragmentation + indexing） ，用于表观基因组分析（epigenomic profiling，如染色质可及性），近年应用渐多；
- 亚硫酸氢盐测序（bisulphite sequencing） ：检测 DNA 甲基化模式；
- RNA 测序（RNA-seq） ：用于转录组（transcriptome）研究。
选择哪种方法取决于研究目的（"Choice of approach depends on your purpose!"）。
3.10 测序数据处理基本流程
课件 p22 给出通用流程（后续课程将展开）：
- 碱基识别（basecalling） ：把测序仪检测的原始信号转换为碱基序列；
- 解复用（demultiplexing） ：混合测序时按标签把读段分回各自样品；
- 质控（quality control） ：检查测序完整性，排除仪器故障、污染、试剂问题等；
- 接头修剪与过滤（adapter trimming & filtering） ：去除接头等人工序列；
- 比对（alignment to reference genome）或从头拼装（de novo assembly） ：有可靠参考基因组时比对；无参考时凭读段重叠拼装，二者的选择取决于测序类型、深度与参考可用性（课堂录音）；
- 比对/拼装后质控 ：评估质量、去重（deduplication）等；
- 下游分析 。
课堂录音强调：测序数据动辄数 GB 至 TB，无法用 Excel 人工查看；以上仅为分析的"准备阶段"。
3.11 常见下游分析类型
- 差异基因表达分析（differential gene expression, DGE） （课件 p23）：RNA 提取 → cDNA 合成 → 文库制备 → 测序与比对 → feature counting （统计比对到每个基因的读段数）→ 计数标准化（针对生物学与技术变异）→ 统计检验 → 得到上调/下调的差异表达基因（DE genes）列表。
- GO 富集分析（GO enrichment analysis） （课件 p24）：在 DE 基因列表中寻找相对于全基因组背景"过度代表（over-represented）"的基因本体（Gene Ontology）条目；GO 条目之间呈分层无环结构（hierarchical acyclic structure）；分两类做法——功能分类（functional classification，描述性） 与富集打分（enrichment scoring，统计性） ；类似分析也可按生物学通路（pathway）进行。
- 变异分析（variant analysis） （课件 p25）：变异检出（calling）→ 过滤（区分真变异与测序错误等假阳性）→ 效应预测（推断生物学后果）。课件举例：比对到 hg38 第 17 号染色体 ERBB2（HER2）基因的序列，需找出与参考序列的偏差并判断其影响。绝大多数序列变异是中性的（<1% 引起表型改变），因此关键是识别有后果的变异（课堂录音：如癌症样本中驱动肿瘤生长的体细胞变异 somatic variants）。
- 群体/比较基因组学（population/comparative genomics） （课件 p26）：研究群体内与群体间、物种间的遗传变异；群体基因组学研究自然选择导致的群体分化模式，比较基因组学研究跨物种的进化与功能保守；常用系统发生学（phylogenetics） 树分析。课堂举例：COVID 各毒株（Alpha、Beta、Omicron 等）的演化关系即属此类分析。
- 宏基因组学（metagenomics） （课件 p27）：研究混合样品中全部生物 的基因组，用于环境微生物群落（细菌、病毒、古菌、真菌、原生生物）分析，以及宿主生殖系 DNA 中的内源性病毒元件（endogenous viral elements, EVEs）。课堂举例：口腔/肠道/皮肤微生物组比较，以及对古埃及木乃伊做宏基因组分析以了解古代饮食与生活方式。
3.12 基因组信息学的挑战与伦理法律考量
挑战 （课件 p28）：
- 数据量与存储 ：测序产出大量数据；
- 计算能力限制 ：算力受限，海量数据需要高效算法；
- 结果解读复杂 ：非编码区变异意义不明、大结构变异分析困难、环境与遗传因素的因果或相关难以区分；
- 数据多样性不足 ：公共数据主要来自欧洲/西方人群（课堂录音：NCBI BLAST 所用数据亦以欧洲来源为主）；
- 可重复性与标准化 ：NGS 分析流程未完全标准化，影响结果重复性（长读长流程更新频繁，长周期项目尤受影响，课堂录音）。
伦理与法律考量 （课件 p29）：
- 数据隐私与安全 ：捐赠者个人遗传信息、匿名化与去标识化（anonymization/deidentification）、数据所有权、AI 分析工具的伦理使用；
- 知情同意（informed consent） ：数据长期存储与研究能力的不断演进之间的矛盾；
- 结果报告 ：基因检测结果的责任性沟通；基因组编辑（genome editing）的可能性；
- 可及性 ：人群代表性不足与基因组技术的公平获取。课堂录音举例：纳米孔虽便携，但一个 flow cell 约 500 美元、约可用 3 次，对资源有限地区仍不便宜；沟通上也需谨慎——未检出某癌症标志物不等于不会患该癌症。
四、关键图解
p6：标志性基因组项目一览——从 Human Genome Project、International HapMap、1000/100,000 Genomes 到 ENCODE 与 Human Pangenome Project，各项目分别贡献了参考序列、基因型—表型关联、dbSNP 与 GENCODE 注释等资源。
p9：芯片（microarray）工作原理——样品经标记后与芯片上固定探针杂交，荧光信号经背景校正、标准化与质控后用于定量分析；右侧列出高信号不代表高丰度的四类原因。
p13：第一代鸟枪法测序——NIH 的分级鸟枪法（BAC 克隆分段后再测序）与 Celera 的全基因组鸟枪法（整体打碎直接测序），并标注重复区域带来的拼装困难。
p15：靶向测序、全外显子组测序与全基因组测序在覆盖范围、可检测变异类型、成本与深度上的对比表。
p16：Illumina 测序流程——片段化、接头连接、flow cell 上桥式扩增成簇，再以可逆终止子逐碱基合成测序。
p18：纳米孔测序——马达蛋白牵引 DNA 链穿过纳米孔蛋白，不同碱基引起特征性电流扰动，据此识别碱基序列。
p22：测序数据处理通用流程——basecalling、demultiplexing、质控、接头修剪过滤，随后比对参考基因组或从头拼装，经再次质控后进入下游分析。
p24：GO 富集分析——对差异表达基因列表，分别在描述层面（功能分类）与统计层面（富集打分）寻找过度代表的基因本体条目。
五、课前思考 / 自测
课件本讲未附练习题，以下依据讲义内容自拟：
- 芯片只能检测芯片上已有探针对应的序列。基于这一局限，什么情况下仍应优先选择芯片而非测序？
- 第二代与第三代测序在是否需要扩增、读长、错误来源上有何差异？对完全没有参考基因组的新物种，应选哪类技术并说明理由。
- 靶向 panel、WES、WGS 三种策略各自能检出哪些变异类型？"深度 >500X 与 >30X"的差异由什么决定？
- 从测序仪原始信号到可分析的 BAM/计数矩阵，中间要经过哪些处理步骤？每一步分别解决什么问题？
- GO 富集分析中"功能分类"与"富集打分"两种做法的区别是什么？为什么差异表达基因列表需要做富集分析而不是仅报告基因名？
六、参考材料
- 主课件 ：
Materials/L4_Introduction to Genome Informatics_2026.pdf（30 页，本讲唯一讲课用课件）
- 课堂录音转写 ：
Recordings/MSBS7101-0922-1.txt、Recordings/MSBS7101-0922-2.txt（英文语音识别转写，用于补充课堂讲解细节）
- 课件内引用的关键来源（据课件标注）：Annunziato 2008 (Nature Education, DNA packaging)；Nature Reviews Genetics
s41576-019-0127-1（基因组计划综述）；HKGP 论文10.1016/j.lanwpc.2025.101473；PNAS 042692499（shotgun sequencing）；CMR.00056-16（测序技术综述）；nrg2626（PacBio）；C9AN00506D（Ion Torrent）；mco2.316 与 10.1002/（nanopore 相关）。
七、课堂要点补充（来源：课堂录音）
- HKGP 案例 ：讲者展示一项 HKGP 应用——对极罕见疾病阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症（proximal kinesigenic choreoathetosis，全球报道不足 1 万例）开展遗传咨询与测序，用于患者管理、家系沟通与血亲预防；论文见课件 p7 所引 DOI。
- GENCODE 版本 ：课件提示 GENCODE v48，课堂作业实际使用 v50。
- HGP 竞争史 ：2003 年前 NIH（分级鸟枪法）与 Celera（全基因组鸟枪法）竞争谁先完成人类基因组测序，策略差异见 3.4 节。
- 技术选型经验法则 ：全新物种选长读长；已知目标、要求低错误率与快速出数据选 Illumina（医院默认平台）；长读长需数天，短读长数小时至过夜。
- 成本实例 ：Ultima Genomics 2024 年宣称 100 美元/人类基因组（讲者未见研究实验室实际采用）；ONT flow cell 约 500 美元/个、约可用 3 次——可及性仍是基因组技术普及的主要限制。
- 长读长的现实困难 ：三代技术较新，样品制备与分析流程常无成熟标准方案，软件与"教科书流程"频繁更新，长周期项目的结果解读可能受影响；长读长数据错误率较高且验证材料有限。
- 下节课准备 ：上机课需自带充满电的笔记本电脑 ，将使用 Google Colab 与 IGV （本地基因组浏览器，替代 UCSC Genome Browser）分析预制的测序数据，请提前熟悉 Colab。
课前预习笔记，基于课件
L4_Introduction to Genome Informatics_2026.pdf（30 页）与两份课堂录音转写整理；标注"课堂录音"处为讲者口头补充。Loading...
