使用 Annovar 注释 VCF 文件

变异注释是基因组学研究中的关键步骤，帮助研究人员理解变异的功能意义。Annovar (ANNOtate VARiation) 是一个广泛使用的工具，用于对变异进行功能注释。

安装 Annovar

下载 Annovar 需要在 [此处](https://www.openbioinformatics.org/annovar/annovar_download_form.php) 用教育邮箱注册，然后邮箱中会收到下载链接。

+++info 如果你没有教育邮箱

[这里](http://www.openbioinformatics.org/annovar/download/0wgxR2rIVP/annovar.latest.tar.gz) 或许是一个可以下载的链接

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解压压缩包

根据自己的习惯看要不要配置环境变量，此处以不配置环境变量为例

Annovar 的可执行文件存放在 `~/annovar/` 下，因此后续使用都要带上这个前缀，为绝对路径调用

准备数据

我的目录结构如下：

其中需要注释的 VCF 文件存在于每个样本的 `gvcf/` 目录下，是一个 `.g.vcf.gz` 文件

简单的示例

步骤 1：转换 VCF 文件

Annovar 使用其专有的输入格式，因此首先需要将 VCF 文件转换为 Annovar 的输入格式。例如对 `16794N.g.vcf.gz` 文件进行转换：

这将生成一个 `sample.avinput` 文件，作为后续注释的输入。

步骤 2：下载 Annovar 数据库

在进行注释之前，需要下载相关的数据库。所有支持的数据库可以在 [官网](https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/) 上找到：

例如，我使用 RefGene, cytoBand, 1000g2015aug, dbnsfp42c, cg69, ljb26_all, snp138 数据库进行注释：

RefGene 数据库已经在 `humandb/` 目录下，不需要下载

步骤 3：变异注释

下载完数据库后，可以开始注释 VCF 文件中的变异。例如对样本 `16794N` 进行注释：

在这个命令中：

`-buildver hg19` 指定参考基因组版本。

`-out sample` 指定输出文件的前缀。

`-remove` 表示注释完成后删除中间文件。

`-protocol` 指定使用的数据库，这里使用了 `refGene`、`cytoBand`、`1000g2015aug_all`、`1000g2015aug_eur`、`1000g2015aug_afr`、`dbnsfp42c`、`cg69`、`ljb26_all`、`snp138`。

`-operation` 指定每个数据库的操作类型，`g` 表示基因注释，`r` 表示区域注释，`f` 表示过滤数据库。

`-nastring .` 指定将缺失值表示为 "."

`-csvout` 表示输出文件为 CSV 格式。

步骤 4：查看结果

由于我们删除了中间文件，注释完成后我们将只得到 1 个 csv 输出文件 `16794B.hg19_multianno.csv`

批量操作

现在我们对 22 个样本进行批量注释：

使用循环

如果服务器比较拥挤，可以使用循环：

写入以下代码：

赋予执行权限，并使用 nohup 命令后台运行：

同时进行

当我们的 vcf 文件很大的时候，转换和注释通常非常耗时，因此在服务器空闲的情况下我们可以同时进行：

写入以下代码：

赋予执行权限，并使用 nohup 命令后台运行：

结果处理

查看注释结果

发现有些值两侧有引号，这会对后面的处理产生影响，需要去除引号

写入以下代码：

赋予执行权限，并使用 nohup 命令后台运行：

筛选并合并所有样本的注释

写入以下代码：

赋予执行权限，并使用 nohup 命令后台运行：

Annovar 注释结果与 MAF 文件的转换

MAF 文件是 Mutation Annotation Format 文件的缩写，是一种用于存储基因突变注释信息的标准文件格式。

如果你的 Annovar 注释结果比较多

可以使用 [annovar2maf](https://github.com/PoisonAlien/annovar2maf)

这是一个 python 编写的脚本，不过他是针对 txt 文件的，由于我们的注释结果保存为了 csv 文件，需要将脚本中的 `line.split("\t")` 替换为 `line.split(",")`

以下是替换后的脚本

此脚本会在第一列添加一列脚本自定义的 `Tumor_Sample_Barcode`，使用以下命令去除：

生成的 `merged_annotations_python.maf` 文件可以使用 R 语言的 `maftools` 包来直接进行分析和绘图

如果你的 Annovar 注释结果比较少

我们可以使用 R 语言的 `maftools` 包来直接进行转换、分析和绘图：

使用 R 包转换的文件会稍大一点，但是它们的绘图结果是一致的。